3 注射用红色诺卡氏菌细胞壁骨架药典标准
3.1 中文名
3.2 汉语拼音
Zhusheyong Hongse Nuokashijun Xibaobi Gujia
3.3 英文名
Nocardia Rubra Cell Wall Skeleton for Injection
3.4 定义、组成及用途
本品系用红色诺卡氏菌经发酵、破碎、提取获得细胞壁骨架（N-CWS），加入适量乳化剂后冻干制成，主要含该细胞壁的组分霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽等。不含防腐剂和抗生素。
3.5 1．基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
3.6 2．制造
3.6.1 2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
3.6.1.1 2.1.1 名称及来源
采用红色诺卡氏菌PO-8株。
3.6.1.2 2.1.2 种子批的建立
3.6.1.3 2.1.3 种子批的传代
主种子批启开后传代次数不得超过5代。工作种子批启开后至生产，传代不超过5代。
3.6.2 2.1.4 种子批检定
3.6.2.1 2.1.4.1 生长特性
在营养琼脂上生长良好，菌落为红色至橙红色。马铃薯块上生长良好，菌落小，隆起，不整齐，红色至橙红色。在肉汤培养基中培养7天，液面边缘有菌环，红色至橙红色，液体应澄清，有颗粒状菌落沉淀。
3.6.2.2 2.1.4.2 生化反应
3.6.3 2.1.5 菌种保存
主种子批菌种应冻干保存于8℃以下或20%甘油中低温保存于-20℃以下。
3.6.4 2.2 原粉
2.2.1 生产用种子
将检定合格的工作种子批菌种在葡萄糖－酵母浸粉培养基中于26～30℃振荡培养不超过48小时。涂片镜检，无污染杂菌者方可用于接种。
2.2.2 生产用培养基
3.6.4.1 2.2.3 培养
在灭菌培养基中接种适量种子液，振荡通气培养，培养物于对数生长期后期收获，在培养结束后涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
3.6.4.2 2.2.4 收获
收集培养液，离心收获湿菌体。
3.6.4.3 2.2.5 破壁及粗提
2.2.5.1 湿菌体加灭菌纯化水，采用超声波或其他经批准的适宜方法破碎菌体。
2.2.5.2 分别加胰蛋白酶－糜蛋白酶和链蛋白酶水解16～24小时，离心，获细胞壁粗提物。
3.6.4.4 2.2.6 提取
3.6.4.5 2.2.7 干燥研磨
溶媒提取后的细胞壁骨架于60℃减压干燥，研磨，获得的N-CWS原粉置一20℃干燥保存，有效期为24个月。
3.6.4.6 2.2.8 原粉检定
按3.1项进行。
3.6.5 2.3 半成品
3.6.5.1 2.3.1 配制
检定合格的N-CWS原粉，加入角鲨烯、甘露醇、聚山梨酯80和注射用水乳化成均匀的白色混悬液，经除菌过滤后供灌装。根据所测阿拉伯糖含量，使每瓶含N-CWS 200μg。
3.6.5.2 2.3.2 检定
按3.2项进行。
3.6.6 2.4 成品
3.6.6.1 2.4.1 分批
3.6.6.2 2.4.2 分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”及2010年版药典三部附录Ⅰ A 有关规定。
3.6.6.3 2.4.3 规格
每瓶含N-CWS 200μg。
3.6.6.4 2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及2010年版药典三部附录Ⅰ A 有关规定。
3.7 3．检定
3.7.1 3.1 原粉检定
3.7.1.1 3.1.1 外观
应为类白色粉末，不溶于水与有机溶剂。
3.7.1.2 3.1.2 定性检定
取本品适量，按3.3.1项进行。
3.7.1.3 3.1.3 干燥失重
取本品50mg，在105℃干燥至恒重，减失重量应不高于5%（2010年版药典三部附录Ⅶ L）。
3.7.1.4 3.1.4 微生物限度
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ G），应符合规定。
3.7.2 3.2 半成品检定
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.7.3 3.3 成品检定
3.7.3.1 3.3.1 鉴别试验
3.3.1.1 细胞壁糖
取本品1瓶，加纯化水1.0ml，溶解后吸取0.5ml于试管中，滴加0.05%蒽酮硫酸溶液1.0ml，摇匀即呈黄绿色至蓝绿色。
取二氨基庚二酸、丙氨酸适量，分别加入50%乙醇配制成0.05mg/ml二氨基庚二酸对照品溶液和0.1mg/ml丙氨酸对照品溶液。取本品5瓶，混合，加6mol/L的盐酸溶液0.5ml，密封，在蒸气灭菌器中120℃水解3～6小时，水解液蒸干，残渣加50%乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
照薄层色谱法（2010年版药典二部附录Ⅴ B）取丙氨酸对照品溶液和供试品溶液各2μl，以正丁醇－冰醋酸－水（8：3：1）为展开剂，取二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液各5μl，以十二烷基硫酸钠－正丁醇－正己烷－水（6：25：6：20）为展开剂，分别点样于硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液主斑点一致。
3.7.3.2 3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观为白色疏松体。复溶后应成白色均匀的混悬液。
3.3.2.2 复溶时间
加入注射用水后，复溶时间应不超过1分钟。
3.3.2.3 可见异物
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅴ B），应符合规定。
3.3.2.4 装量差异
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅰ A），应符合规定。
3.7.3.3 3.3.3 化学检定
3.3.3.1 pH值
应为5.0～7.0（2010年版药典三部附录Ⅴ A）。
3.3.3.2 水分
应不高于3.0%（2010年版药典三部附录Ⅶ D）。
精密称取甲醇1g、三氯甲烷0.1g，同置于5ml容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，再加适量水制成每1ml中约含甲醇20μg、氯仿2μg的混合溶液，精密量取混合液3.0ml置10ml顶空瓶中作为对照品溶液。取本品10瓶，分别精密加入3.0ml水使溶解，混合，摇匀，精密量取3.0ml置10ml顶空瓶中作为供试品溶液。照残留溶剂测定法（2010年版药典二部附录ⅥV），以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷为固定液（或极性相近）的毛细管柱为色谱柱，起始温度为40℃，维持11分钟，再以每分钟25℃的速率升温至180℃，维持6分钟，进样口温度180℃，检测器温度220℃，顶空瓶平衡温度为70℃，平衡时间为30分钟。取对照品和供试品溶液气液平衡后的液上气体500μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，甲醇残留量应不高于0.2%，三氯甲烷残留量应不高于0.003%。
3.3.3.4 聚山梨酯80含量测定
取本品10瓶，分别加入适量纯化水，溶解并稀释至100ml，精密量取1.0ml，按聚山梨酯80残留量测定法（2010年版药典二部附录Ⅵ H）进行测定，每瓶含聚山梨酯80应小于1mg。
3.7.3.4 3.3.4 无菌检查
依法检查（2010年版药典二部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.7.3.5 3.3.5 异常毒性检查
依法检查（2010年版药典二部附录Ⅻ F），应符合规定。
3.7.3.6 3.3.6 细胞壁骨架（N-CWS）含量测定
细胞壁骨架（N-CWS）由霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽等成分组成，其中含33%阿拉伯糖，本检测是通过测定阿拉伯糖含量推算N-CWS含量。
精密称取在60℃减压干燥1小时的阿拉伯糖和半乳糖（用于排除干扰）适量，分别加纯化水制成20mg/ml的溶液。精密量取阿拉伯糖溶液2.5ml和半乳糖溶液1.2ml，置10ml容量瓶中，加相应空白溶液至刻度，摇匀，制成5mg/ml阿拉伯糖的对照品溶液。再精密吸取对照品溶液适量，加纯化水稀释成40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml及120μg/ml的阿拉伯糖系列溶液。以水做空白，精密量取上述系列溶液和水各2.0ml，置具塞试管中，在冰水浴中，分别缓慢滴加2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.5ml，浓硫酸4.0ml，小心摇匀，于80℃水浴保温30分钟，立即用流水冲冷至室温，按紫外－可见分光光度法（2010年版药典二部附录Ⅱ A）于625nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以阿拉伯糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取供试品10瓶，分别精密加入1.0ml纯化水，混合，摇匀，作为供试品溶液。以水为空白，精密量取供试品溶液2.0ml，同法于625nm波长处测定吸光度，代人标准曲线。计算供试品溶液中阿拉伯糖含量，阿拉伯糖含量应为66～104μg/瓶，折算成N-CWS含量应不低于200μg/瓶。
3.7.3.7 3.3.7 抑瘤试验
将S180腹水瘤细胞与本品混合均匀，皮下接种于实验小鼠，2周后解剖动物，称瘤重，计算抑瘤率应不低于50%。
取体重为18～20gBALB/c小鼠20只，试验组及对照组各10只，抽取S180腹水瘤，计数后稀释成2×107个细胞/ml，将N-CWS溶于生理氯化钠溶液，制成2000μg/ml。取1.0ml瘤细胞与1.0mlN-CWS液混合均匀，做为试验组样品。同时取1.0ml角鲨烯、甘露醇和聚山梨酯80的混合液（与配制半成品时相同的浓度和比例）与1.0ml瘤细胞混合作为对照组注射用。分别对小鼠皮下注射，每只0.2ml（200μg N-CWS/只），接种后14天解剖动物，取瘤并称重，按下式计算抑瘤率。
3.8 4．保存、运输及有效期
于4～20℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。
3.9 5．使用说明
3.10 版本
《中华人民共和国药典》（2010年版 第三增补本）