3 外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子药典标准
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 汉语拼音
Waiyong Chongzu Niu Jianxing Chengxianweixibao Shengzhangyinzi
3.1.3 英文名
Recombinant Bovine Basic FibroblastGrowth Factor for External Use
3.2 定义、组成及用途
本品系由高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
3.3 1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
3.4 2 制造
3.4.1 2.1 工程菌菌种
3.4.1.1 2.1.1 名称及来源
重组牛碱性成纤维细胞生长因子工程菌株系由带有牛碱性成纤维细胞生长因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
3.4.1.2 2.1.2 种子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 菌种检定
3.4.1.3.1 2.1.3.1 划种LB琼脂平板
3.4.1.3.2 2.1.3.2 染色镜检
3.4.1.3.3 2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
3.4.1.3.4 2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
3.4.1.3.5 2.1.3.5 生化反应
3.4.1.3.6 2.1.3.6 牛碱性成纤维细胞生长因子表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
3.4.1.3.7 2.1.3.7 质粒检查
3.4.1.3.8 2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
3.4.2.2 2.2.2 发酵用培养基
3.4.2.3 2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（2010年版药典三部附录Ⅸ G）。
3.4.2.4 2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集、处理菌体。
3.4.2.5 2.2.5 纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其达到3.1项要求，即为重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液。加入稳定剂，除菌过滤后于适宜温度下保存，并规定其有效期。
3.4.2.6 2.2.6 原液检定
按3.1项进行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配制与除菌
3.4.3.1.1 2.3.1.1 稀释液配制
按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。
3.4.3.1.2 2.3.1.2 稀释与除菌
将检定合格加稳定剂的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃：
3.4.3.1.3 2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分装及冻干
3.4.4.3 2.4.3 规格
应为经批准的规格。
3.4.4.4 2.4.4 包装
3.5 3 检定
3.5.1 3.1 原液检定
3.5.1.1 3.1.1 生物学活性
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅹ G）。
3.5.1.2 3.1.2 蛋白质含量
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅵ B第二法）。
3.5.1.3 3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.7×105IU。
3.5.1.4 3.1.4 纯度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 电泳法
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅲ B）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸－水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸－乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0～70%B相）。上样量应不低于10μg，在波长280nm处检测，以牛碱性成纤维细胞生长因子色谱峰计算的理论板数应不低于2000。按面积归一化法计算，牛碱性成纤维细胞生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.5.1.5 3.1.5 分子量
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，供试品2条蛋白质电泳区带的分子质量应分别为17.5kD±1.8kD和22.0kD±2.2kD。
3.5.1.6 3.1.6 外源性DNA残留量
每1次人用剂量应不高于10ng（2010年版药典三部附录Ⅸ B）。
3.5.1.7 3.1.7 等电点
主区带应为9.0～10.0，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（2010年版药典三部附录Ⅳ D）。
3.5.1.8 3.1.8 紫外光谱
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm（2010年版药典三部附录Ⅱ A）。
3.5.1.9 3.1.9 肽图
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅷ E），应与对照品图形一致。
3.5.2 3.2 半成品检定
3.5.2.1 3.2.1 生物学活性
依法测定（2010年版药典三部附录Ⅹ G），应符合规定。
3.5.2.2 3.2.2 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.5.3 3.3 成品检定
除复溶时间、水分测定和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用永，复溶后进行其余各项检定。
3.5.3.1 3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法（2010年版药典三部附录Ⅷ A）或免疫斑点法（2010年版药典三部附录Ⅷ B）测定，应为阳性。
3.5.3.2 3.3.2 物理检查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外观
应为白色或微黄色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后应为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 复溶时间
按标示量加入灭菌注射用水后轻轻摇匀，应在10分钟内溶解为澄明液体。
3.5.3.2.3 3.3.2.3 装量差异
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅰ D），应符合规定。
3.5.3.3 3.3.3 化学检定
3.5.3.3.1 3.3.3.1 水分
应不高于3.0%（2010年版药典三部附录Ⅶ D）。
3.5.3.3.2 3.3.3.2 pH值
应为6.5～7.5（2010年版药典三部附录Ⅴ A）。
3.5.3.4 3.3.4 生物学活性
应为标示量的70%～200%（2010年版药典三部附录Ⅹ G）。
3.5.3.5 3.3.5 无菌检查
依法检查（2010年版药典三部附录Ⅻ A），应符合规定。
3.6 4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
3.7 5 使用说明
3.8 版本
《中华人民共和国药典》2010年版