1 拼音
2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅳ
电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，带电粒子按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外，各电泳法照下述方法操作。
2 附录Ⅳ A 醋酸纤维素薄膜电泳法
2.1 试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。
（2）氨基黑染色液 称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（3）漂洗液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
2.2 测定法
取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液（pH8.6）的电泳槽架上，通过滤纸桥浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中。于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液2～3μl，在0.4～0.6mA/cm[总电流量=电流量（mA/cm）×每条膜的宽度（cm）×膜条数]电流条件下电泳；同时取新鲜人血清作对照，电泳时间以白蛋白与丙种球蛋白之阿的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中，待全部浸透后，取出平铺于洁净的玻板上，干燥后即成透明薄膜，可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白质组分曲线图，以人血清作对照，按峰面积计算各蛋白质组分的含量（%）。
2.3 【附注】
3 附录Ⅳ B 琼脂糖凝胶电泳法
3.1 试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g，加水适量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠0.15g，溶解后，加水稀释至1500ml。
和巴比妥缓冲液（pH8.6） 50ml，加热使完全溶胀。
（3）0.5%氨基黑溶液 称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（4）脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
（5）溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使之溶解，并稀释至100ml。
3.2 对照品
正常人血清或其他适宜的对照品。
3.3 供试品溶液的制备
用生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1%～2%的溶液。
3.4 测定法
趁热将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，其厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气
泡的均匀薄层后，于琼脂糖凝胶板负极端的1/3处打孔，孔径2～3mm。置含有巴比妥缓冲液（pH8.6）的电泳槽架上，测定孔加适量供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及1滴溴酚蓝指示液。用3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液（pH8.6）接触，100V恒压条件下电泳2小时（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，用0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景无色。
4 附录Ⅳ C SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
4.1 仪器
恒压或恒流电源，垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。
4.2 试剂
（1）水（电阻率不低于18.2MΩ·cm）。
（2）A液 1.5molL三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8．加水稀释至100ml。
（3）B液 30%蔼烯酰胺－0.8% N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。
（5）D液 10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺溶液。（6）E液 10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
（7）F液 0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6.05g加适量水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。
（8）电极缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.3，加水稀释至1000ml。
（9）供试品缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷0.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g，量取盐酸0.189ml、甘油4ml，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，如用于还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇2ml。
（10）分子量标准 供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。
（11）固定液 量取甲醇250ml、冰醋酸60ml，加水稀释至500ml。
（12）漂洗液 量取乙醇100ml、冰醋酸50ml，加水稀释至1000ml。
（13）辅染液 称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml。用前40倍稀释。
（14）银染液 称取硝酸银2.04g．加水溶解并稀释至1000ml。
（15）显色液 称取碳酸钠30g，加适量水溶解，加甲醛0.5ml并稀释至1000ml。
（16）终止液 量取冰醋酸10ml，加水稀释至1000ml。（17）考马斯亮蓝染色液 称取考马斯亮蓝R250 1g，加入甲醇200ml、冰醋酸50ml、水250ml，混匀。
（18）考马斯亮蓝脱色液 量取甲醇400ml、冰醋酸100ml与水500ml，混匀。
4.3 供试品溶液的制备
将供试品与供试品缓冲液按3：1的比例混匀，100℃水浴加热3～5分钟。
4.4 测定法
（1）制备分离胶溶液 按下表制成分离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。
凝胶种类 | 浓缩胶 | |||||||
凝胶浓度 | 5% | 7. 5% | 10% | 12.5% | 15% | 17.5% | 4.5% | |
A液 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
B液 | 2.7 | 4 | 5.4 | 6.7 | 8 | 9.4 | 1.35 | |
C液 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 0.9 | |
试液/ml | D液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.07 |
E液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.07 | |
F液 | 2.25 | |||||||
H2O | 7.3 | 6 | 4.88 | 3.3 | 2.28 | 0.88 | 4.33 | |
（2）制各浓缩胶溶液 待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶溶液（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。
（3）加样 待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在供试品孔中加入供试品溶液5μg（银染法）或10μg以上（考马斯亮蓝染色法）。
（4）电泳 接通电源、冷凝水，以恒流10mA条件下开始电泳，至供试品溶液进入分离胶后将电流调至20mA，直至电泳结束。
（5）固定与染色
①银染法 除另有规定外，银染法一般不用于定量试验；做定性试验时，上样量可以适当增加。将电泳后的凝胶浸入固定液中过夜，取出，用漂洗液漂洗3次（温度应不低于25℃），每次10分钟；漂洗后的凝胶浸于辅染液中7～10分钟后取出，用水浸洗3次，每次2分钟；将浸洗后的凝胶浸于银染液中，置较强日光或类似光源下照射30分钟，再于室内光线下放置20分钟；将凝胶自银染液中取出，用水浸洗2次，每次1分钟；然后将凝胶浸于显色液中，每隔2分钟换液1次，直至蛋白质条带显色完全；将凝胶浸于终止液中10分钟后，取出凝胶保存于水中。
②考马斯亮蓝法 将电泳后的凝胶浸入染色液中过夜取出，浸入脱色液中，直至凝胶底色几乎无色，取出凝胶保存在水中。
4.5 结果计算
非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶经扫描进行纯度分析；还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶中分子量标准，经扫描获得分子量标准曲线，计算供试品的分子量。
5 附录Ⅳ D 等电聚焦电泳法
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白质类供试品的等电点。
5.1 第一法 等电聚焦垂直板电泳
5.1.1 试剂
（1）水（电阻率不低于18.2MΩ·cm）。
（2）A液 称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
（4）供试品缓冲液（4倍浓度） 量取甘油8ml、40%两性电解质（pH3～10）溶液4ml，加水至20ml。加0.1%甲基红溶液20μl。
（5）固定液 称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g，加水溶解并稀释至300ml。
（6）脱色液（平衡液） 量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
（7）染色液 称取考马斯亮蓝G250（或R250）0.35g，加脱色液300ml，在60～70℃水浴中加热，使溶解。
（9）正极液（0.01mol/L磷酸溶液） 量取磷酸1ml，加水至1800ml。
（10）负极液（0.01mol/L氢氧化钠溶液） 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
5.1.2 供试品溶液的制备
供试品对水透析（或用其他方法）脱盐后，与供试品缓冲液按3:1（体积比）混匀（供试品溶液最终浓度应在每1ml含0.5mg以上，如供试品浓度太低，则需要采用适当方法浓缩）。
5.1.3 测定法
装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入60%甘油1ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、两性电解质（pH3～10）溶液（或其他两性电解质）1.0ml，混匀，脱气，再加B液72μl，N,N,N',N'-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合1小时。每孔加供试品缓冲液20μl，接通冷却循环水，于10℃、250V（约10mA）条件下电泳30分钟。每孔加样20μl，于10℃、500v（约10mA），上限电压2000V条件下，电泳约3.5小时，同时做等电点标准。电泳结束后，即将凝胶放入固定液中固定20分钟以上；取出，放入平衡液中20～30分钟；再放入染色液中40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放入保存液中30分钟；亦可做成干胶保存。以标准品的等电点（pI）对其相应的迁移距离作直线回归，将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
5.2 第二法 等电聚焦水平板电泳
5.2.1 试剂
（1）水（电阻率应不低于18MΩ·cm）。
（2）A液 称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
（4）固定液 称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g，加水溶解并稀释至300ml。
（5）脱色液（平衡液） 量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml．加水稀释至2000ml。
（6）染色液 称取考马斯亮蓝G250（或R250）0.35g，加脱色液300ml，在60～70℃水浴中加热，使溶解。
（8）正极液（0.5mol/L磷酸溶液） 量取磷酸50ml．加水至1800ml。
（9）负极液（0.2mol/L氢氧化钠溶液） 称取氢氧化钠8g，加水溶解并稀释至1000ml。
5.2.2 供试品溶液的制备
将供试品对水透析（或用其他方法）脱盐，并使蛋白质含量调节至每1ml含0.5mg以上（如供试品蛋白质浓度太低，则需采用适当方法浓缩）。
5.2.3 测定法
量取A液6.25ml、pH 3～10两性电解质（或其他两性电解质）1.5ml、水17.1ml，抽气5～10分钟，加B液175μl、N,N,N',N'-四甲基乙二胺20μl，混匀后缓慢地注入水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将加样滤纸放在凝胶上。加供试品溶液5～30μl。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压2000V、上限电流50mA、功率为每1cm胶1W、温度4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳2.5小时；同时做等电点标准。电泳30分钟后去掉加样滤纸，电泳结束后，即将凝胶放入固定液中固定20分钟以上；取出放入平衡液20～30分钟，再放入染色液40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放入保存液中30分钟，晾干；亦可做成干胶永久保存。以标准品的等电点（pI）对其相应的迁移距离作直线回归，将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。