7 脱氧核糖核酸染色的原理
末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)是一种细胞内酶,催化细胞的脱氧核苷酸,使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3'-OH端而无需模板指导。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应,可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术用辣根过氧化酶-抗酶复合物(PAP immunocomplex)在细胞涂片或组织切片上定位显示细胞内的TdT。
8 试剂
(1)正常兔血清IgG。
(2)免抗牛TdT抗体1∶8稀释。
(3)羊抗兔IgG 1∶10稀释。
(4)PAP免疫复合物(PAP immunocomplex from rabbit)1∶20稀释。
(5)二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)溶液0.05mol/L Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)100ml,含过氧化氢(V/V)为0.03%,4℃保存,用前加入30mg DAB,溶解后过滤,立即避光使用。
9 操作方法
(1)新鲜抗凝血标本,用比重1.077的淋巴细胞分离液作密度梯度分离,取淋巴细胞层细胞离心涂片,空气干燥。或不作细胞分离,直接涂片。
(2)涂片用过氧化氢-甲醇液于4℃下固定20~30min,以阻断细胞的内源性过氧化酶。
(3)涂片在0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡15min,滴加正常兔血清,以减少抗体非特异性结合。
(4)滴加兔抗牛TdT抗体,37℃保温30min。
(5)滴加羊抗兔IgG抗体,37℃保温30min。
(6)滴加PAP免疫复合物,37℃保温30min。
(7)将涂片浸入DAB溶液,室温作用5~10min。
(8)水洗5min,干后镜检,或用哈氏苏木素染液复染胞核10min。