2 概述
蝉花（Isaria cicadaeMiq.）子实体（人工培植）为新食品原料，又名蝉棒束孢子实体，在我国浙江、广东、福建、四川等省民间具有食用历史。蝉花子实体（人工培植）是将蝉花菌种接种到培养基上进行人工培养，经采收子座（即孢梗束）、干燥等工艺制成，含有蛋白质、多糖等成分，其推荐食用量为≤3克/天（以干品计）。蝉花子实体（人工培植）在婴幼儿、孕妇、哺乳期妇女、食用菌过敏者人群中的食用安全性资料不足，从风险预防原则考虑，上述人群不宜食用，标签及介绍中应当标注不适宜人群。
2020年12月28日国家卫生健康委发布《关于蝉花子实体（人工培植）等15种“三新食品”的公告》，宣布对蝉花子实体（人工培植）的安全性评估材料审查通过。
该原料食品安全指标按照我国现行食品安全国家标准中食用菌类的规定执行。此外，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮不得检出；白僵菌素含量≤3 mg/kg。
6 推荐食用量
≤3 克/天（以干品计）[1]
7 注意事项
1.婴幼儿、孕妇、哺乳期妇女及食用菌过敏者不宜食用，标签及介绍应当标注不适宜人群。
2.食品安全指标按照我国现行食品安全国家标准中食用菌类的规定执行。黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素 A、玉米赤霉烯酮不得检出；白僵菌素含量≤3 mg/kg。
8 蝉花子实体中白僵菌素的检测方法
8.1 1 范围
本方法规定了蝉花子实体原料中白僵菌素的检测方法。适用于蝉花子实体中白僵菌素的检测。
8.2 2 原理
试样中的白僵菌素，用乙腈-水溶液提取，提取液经固相萃取柱净化后，超高压液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。
8.3 3 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇（CH4O）：色谱纯。
3.1.2 乙腈（C2H3ON）：色谱纯。
3.1.3 甲酸（CH3COOH)：色谱纯。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙腈-水溶液（85+15）：量取 150 mL 水加入到 850 mL 乙腈中，混匀。
3.2.2 乙腈-水溶液（10+90）：量取 900 mL 水加入到 100 mL 乙腈中，混匀。
3.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：量取 500 mL 水加入到 500 mL 乙腈中，混匀。
3.2.4 乙腈-水溶液（90+10）：量取 100 mL 水加入到 900 mL 乙腈中，混匀。
3.2.5 0.2%甲酸-水溶液：准确量取 2 mL 甲酸加入到 1000 mL 水中，混匀。
3.3 标准品
白僵菌素（BEA，C45H57N3O9 ，CAS号：26048-05-5）：纯度≥97%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液（1.00 mg/mL）：称取 BEA 10 mg（精确至 0.01mg），用乙腈溶解并定容至 10 mL。将溶液转移至试剂瓶中，在-20℃下密封保存，有效期一年。
3.4.2 标准工作溶液 1（60.0 µg/mL）：准确吸取 1.00 mg/mL BEA 标准储备液 0.6 mL 于 10 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.3 标准工作溶液 2（6.00 µg/mL）：准确吸取 60.0 µg/mL 标准工作溶液 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
8.4 4 仪器和设备
4.1 液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。
4.2 电子天平：感应量 0.01 g 和 0.00001 g。
4.3 涡旋振荡器。
4.4 固相萃取装置。
4.5 固相萃取柱：兼具亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二乙烯基苯）吸附剂填料的固相萃取小柱，200 mg，3 mL，或相当者。
4.6 高速离心机
4.7 匀浆机
4.8 水相微孔滤膜：0.22 μm。
8.5 5 分析步骤
8.5.1 5.1 试样提取
称取2 g（准确至0.01 g）试样于50 mL离心管（或均质袋）中，加入40.0 mL（V1）乙腈-水（85+15），高速混匀120 s，置于涡旋振荡器中180 rpm振荡提取30 min，室温静置15–20 min。移取10 mL上清液（V2）于50 mL离心管中，加入20 mL（V3）超纯水进行稀释，涡旋混匀后室温静置15–20 min，收集上清液于干净的容器中备用。
8.5.2 5.2 试样净化
取4 mL（V4）上清液全部通过事先用3 mL甲醇和3 mL超纯水预先活化的SPE柱，再依次用3 mL 10%乙腈水溶液和3 mL 50%乙腈水溶液淋洗、负压下抽干SPE柱。最后用2 mL（V）90%乙腈水溶液洗脱，负压下抽干SPE柱并收集洗脱液，涡旋混匀，采用0.22 μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。
8.5.3 5.3 液相色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
a) 色谱柱：C18柱（柱长 100 mm，柱内径 2.1 mm，填料粒径 1.7μm）；
c) 梯度洗脱：0–1 min，80%A；3 min，60% A；12 min，30%A；12.1–15.0 min，10% A；15.1–17.0 min，80% A；
d)流速：0.30 mL/min；
e) 柱温：35℃；
f) 进样体积：2 µL。
8.5.4 5.4 质谱参考条件
质谱参考条件列出如下:
b)扫描时间（Scan Time）：0.5 sec；
c) 离子源： Tube Spray；电离方式：ESI+；离子喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；
d)碰撞解离能量 CAD medium；
e) 气体 1（Ion Source Gas 1） 55 psi；气体 2（Ion Source Gas 2）55 psi；气帘气（Curtain Gas，CUR）35 psi；
f) 离子选择参数：参见表 A.1；
表 A.1 离子选择参数表
8.5.5 5.5 定性测定
目标化合物的定性以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的 LC-MS/MS 色谱峰相对丰度进行。试样中目标化合物对应色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰相比较，变化范围应在±2.5%之内。
试样中与标准溶液中目标化合物色谱峰丰度比，同一检测批次样品中目标化合物的两对离子对应的 LC-MS/MS 色谱峰相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表 A.2 规定的范围。
8.5.6 5.6 标准曲线的制作
准确称取不含目标物的蝉花子实体干粉 6 份，每份为 2 g（精确至0.01 g），分别加入 6.00 µg/mL 标准工作溶液 5 μL、10 μL、50 μL、100μL、200 μL 和 500 μL，按照“5.1、5.2”的步骤操作，得浓度分别为 0.5ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 的系列基质匹配标准溶液。
5.6.2 标准曲线
在 5.3、5.4 的液相色谱串联质谱仪分析条件下，将基质匹配标准溶液由低到高浓度进样检测，外标法定量，以 BEA 色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于 0.99。
8.5.7 5.7 试样溶液的测定
取 5.2 处理得到的待测溶液进样，外标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按第 6 章计算样品中待测物的含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量重新测定。
8.5.8 5.8 空白试验
不称取试样，按 5.1 和 5.2 的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
8.6 6 分析结果的表述
试样中 BEA 的含量按式（1）计算。
式中：
X——试样中 BEA 的含量，单位为微克每百克（µg/100g）；
ρ——试样中 BEA 按照外标法在标准校正曲线中对应的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
f——样液稀释因子；
m——试样的称样量，单位为克（g）；
1000——换算系数。
计算结果保留三位有效数字。
8.7 7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。
8.8 8 其他
当称原料试样 2.0 g 时，方法中的白僵菌素检出限为 0.5 μg/kg，定量限为 1.5 μg/kg。
8.9 附录 A.1 白僵菌素标准物质多反应监测（MRM）色谱图
图 A.1 5μg/L 白僵菌素标准物质多反应监测（MRM）色谱图
1.白僵菌素定量离子色谱图（801.4>244.1）
9 参考资料
- ^ [1] 国家卫生健康委．关于蝉花子实体（人工培植）等15种“三新食品”的公告[Z]．2020-12-28．