基本信息
ICS 11.020
C 62
中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 571—2017《裂头绦虫幼虫检测》（Detection of diphyllobothroid larvae）由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2017年8月1日《关于发布〈钉螺调查〉等9项推荐性卫生行业标准的通告》（国卫通〔2017〕11号）发布，自2018年2月1日起实施。
发布通知
关于发布《钉螺调查》等9项推荐性卫生行业标准的通告
国卫通〔2017〕11号
现发布《钉螺调查》等9项推荐性卫生行业标准，其编号和名称如下：
WST 563—2017 钉螺调查
WST 564—2017 巴贝虫病诊断
WST 565—2017 蛔虫病诊断
WST 566—2017 片形吸虫病诊断
WST 567—2017 阴道毛滴虫病诊断
WST 568—2017 阿米巴病肠外脓肿诊断
WST 569—2017 疟原虫检测 血涂片镜检法
WST 570—2017 肠道蠕虫检测 改良加藤厚涂片法
WST 571—2017 裂头绦虫幼虫检测
上述标准自2018年2月1日起施行。
特此通告。
国家卫生计生委
2017年8月1日
前言
本标准依据GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局、上海市疾病预防控制中心。
本标准起草人：陈韶红、李树清、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、张永年、李浩、艾琳、郑彬。
标准正文
裂头绦虫幼虫检测
1 范围
本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。
本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
裂头蚴 plerocercoid larvae
裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼虫的总称（参见附录A）。
3.2
阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus或phyllobothrium latum
寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。
3.3
曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni
寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。
4 仪器器材
4.1 生物显微镜。
4.2 体视显微镜。
4.3 PCR扩增仪。
4.4 电泳仪。
4.5 凝胶成像系统。
4.6 超净工作台。
4.7 高速离心机。
4.8 解剖用手术器械。
5 试剂材料
5.1 试剂
胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6×加样缓冲液；100～2000 bp DNA marker；灭菌双蒸馏水（ddH2O）；70%乙醇（配制见附录B的B.1）。
5.2 引物
扩增裂头蚴核糖体DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素C氧化酶（Coxl）引物序列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录B的B.2）。
5.3 阳性对照
阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。
6 检测步骤
6.1 样品准备
6.1.1 样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。
6.1.2 样品采集：采样按照GB/T 18088执行。
6.2 样品检测
6.2.1 压片检查法
用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条／只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果。
6.2.2 蛋白酶消化法
称取样品250 g并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液1：5的比例加入消化液，37℃消化至无肉眼可见的肉组织为止。消化后用0.8mm×0.8mm（10目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参照GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果。
6.2.3 核酸检测法
6.2.3.1 取样
在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。PCR反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。无菌水作空白对照。
6.2.3.2 DNA的提取
（见附录B的B.3）
6.2.3.3 反应体系
总体积为25μL，模板DNA 2μL，上下游引物（10Lmol/L）各0.5μL，dNTPs 2μL，MgCl22.5μL，10xBuffer 2.5μL，Taq酶（5 U/μL） 0.2μL，补充ddH2O至25μL。
6.2.3.4 PCR反应程序
94℃预变性3 min; 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min。
6.2.3.5 电泳
取10μL产物与2μL的6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中。在1×TAE缓冲液中，3 V/cm～4 V/cm电泳约30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。
6.3 结果判定
6.3.1 裂头属的裂头蚴判定
若从鱼体内检出的幼虫大小若长2mm～20 mm，宽2mm～3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（参见附录C）。
6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定
若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长0.5cm～80 cm，宽0.3cm～1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（参见附录C）。
6.3.3 核酸扩增结果判定
6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立。
6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现428 bp的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴。
6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现156 bp的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴。
6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与GenBank上序列进行比对后定种。
附录
附录A（资料性附录）病原学资料
裂头蚴（plerocercoid）是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼虫的总称。裂头科中的裂头属（Dibothriocephalus）又名双叶槽属（Diphyllobothrium）及迭宫属（Spirometra）的裂头蚴可感染人体。
A.1 形态
A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态
阔节裂头蚴长2 mm～20 mm，宽2mm～3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度约1.5μm。
A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态
曼氏裂头蚴长0.5cm～80 cm，宽0.3cm～1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶。
A.2 生活史
阔节裂头绦虫成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小肠内。虫卵随宿主粪便排出后，在15～25℃的水中，经过7d～15d的发育，孵出钩球蚴。当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过2周～3周的发育成原尾蚴。当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后，原尾蚴可在鱼的肌肉、性腺、卵内发育为裂头蚴，裂头蚴并可随着鱼卵排出。当大鱼吞食含有裂头蚴的小鱼或鱼卵后，裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继续生存，直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经5周～6周发育为成虫。成虫在终宿主体内可活5年～13年。可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有：白斑狗鱼（Esox lucius）、江鳕（Lota lota）、河鲈（Perca fluviatilis）、三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）、樱花钩吻鲑（Oncorhynchus masou）、鮻鱼（Liza haematocheila）、溪红点鲑（Salvelinus fontinalis）、虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）、雅罗鱼属鲤（Leuciscus rutilus）、八目鳗（Lampetra japonicum）等。
曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外，在适宜温度下，经过2周～5周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可发育成裂头蚴，人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病。可感染曼氏裂头蚴的第二中间宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主。
附录B（规范性附录）与检测相关的技术方法
B.1 试剂配制
B.1.1 胃蛋白酶消化液
胃蛋白酶2g，浓盐酸0.7 mL，加蒸馏水至100 mL，现用现配。
B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）
三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）242 g，冰乙酸57.1 mL，pH 8.0的0.5 mol/L EDTA液100 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，制成50xTAE缓冲液，混匀4℃保存备用。临用前50倍稀释。
B.1.3 1×TAE使用液
50×TAE 20 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，混匀备用。
B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液
溴化乙锭1g，加蒸馏水定容至100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。
B.1.5 1.5%琼脂糖凝胶
琼脂糖1.5 g，加1xTAE定容至100 mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10 mg/mL溴化乙锭5μL（终浓度0.5μg/mL），轻轻混匀后，制备凝胶。
B.1.6 6×加样缓冲液
溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g，加蒸馏水至100 mL。置4℃保存备用。
B.1.7 商品化试剂盒
Taq酶、dNTP等核酸提取及PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒。
B.2 引物模板
裂头绦虫幼虫相关引物见表B.2
表B.2裂头绦虫幼虫相关引物
相关引物
引物名称 | 引物编号 | 序列 | 片段大小/bp |
裂头蚴ITS通用引物 | 18S-DF1 | 5'-ACTTGATCATTTAGAGGAAGT-3' | 1409 |
28S-DR4 | 5'-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3' | ||
裂头蚴Cox1通用引物 | JB6 | 5'-GATAGTAAGGGTGTTGA-3' | 650 |
JB5R | 5 '-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3' | ||
阔节裂头蚴特异引物 | Dl/Dn-1805F | 5'-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3' | 428 |
Dl-2211R | 5'-TAACCTTTACTTATAACTACT-3' | ||
曼氏裂头蚴特异性引物 | F965 | 5 '-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3' | 156 |
R1120 | 5'-GTTTGGTGCACAGTACGTTTTAAAA-3' |
B.3 DNA的提取
B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤3次，洗涤完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入180μL Buffer ATL，20μL蛋白酶K，混匀后于56℃孵育1～3 h至消化完全，期间不时振荡摇晃。
B.3.2 消化完全后，漩涡震荡15 s，加200μl Buffer AL，立即漩涡振荡混匀，再加入200μl乙醇（96～100%），漩涡振荡混匀。
B.3.3 离心柱置于收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中，8000 r/min离心1 min，弃收集管。
B.3.4 将离心柱置于新的收集管中，加500 μl Buffer AW1，8000 r/min离心1 min，弃收集管。
B.3.5 将离心柱置于新的收集管中，加500 μl Buffer AW2，14000 r/min离心3 min，弃收集管。
B.3.6 将离心柱置于灭菌的1.5 ml离心管中，加入200 μl Buffer AE室温孵育1 min，8000 r/min离心1min，离心所得DNA于-20℃冰箱保存备用（重复该步骤可扩大DNA回收率）。
B.4 实验试剂代码解释（试剂盒自带）
Buffer AL:裂解缓冲液（Lysis buffer）
Buffer AW1:洗涤缓冲液1
Buffer AW2:洗涤缓冲液2
Buffer ATL：组织溶解缓冲液
Buffer AE:溶解缓冲液
附录C（资料性附录）裂头蚴实物图
C.1 白鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.1
C.2 鳟鱼肌肉中的阔节裂头蚴见图C.2
C.3 蛙体内的曼氏裂头蚴见图C.3
C.4 蛇体的曼氏裂头蚴见图C.4
注：图C.1来自参考自文献：Tomàš Scholz, Hector H.Garcia, Roman Kuchta, Barbara Wicht. Update on the Human Broad Tapeworm （Genus Diphyllobothrium）, Including Clinical Relevance. [J] Clin Microbiol Rev.2009 January; 22 （1）:146-160. doi: 10.1128/CMR.00033-08
图C.2. C.3. C.4为检测样品自己拍摄.
参考文献
[1] 吴观陵，人体寄生虫学，第4版，北京：人民卫生出版社，2013.
[2] Scholz T,Garcia HH, Kuchta R,Wicht B.Update on the human broad tapeworm （genus diphyllobothrium）, including clinical relevance. Clin Microbiol Rev.2009,22（1）:146-160.
[3] 余森海，许隆祺，人体寄生虫学彩色图谱，第1版，北京：中国科学技术出版社，1992.
[4] 刘自逵，刘国华，戴荣四，刘伟，李芬，等，湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测
定及种系发育分析，畜牧兽医学报.2010,41: 463-468.
[5] Wicht B,Ruggeri-Bernardi N, Yanagida T,Nakao M, Peduzzi R,et al. Inter-and intra-specific characterization of tapeworms of the genus Diphyllobothrium （Cestoda: Diphyllobothriidea） from Switzerland, using nuclear and mitochondrial DNA targets. Parasitol Int.2010,59:35-39.
[6] SH Chen, L Ai, YN Zhang, JX Chen, WZ Zhang, et al. Molecular Detection of Diphyllobothrium nihonkaiense in Humans, China. Emerg Infect Dis,2014,20:315-318.
