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第四节 影响PCR的主要因素
...久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持TaqDNA聚合酶的活力,加入TaqDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。 2.引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,...
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由普通PCR向快速PCR的革命—BioDev
...、耗材、试剂,不具有普遍性,而且对PCR的改进受到TaqDNA聚合酶本身扩增性能的限制,缩短PCR反应时间有限,而且会常常会影响到PCR的扩增效率。为解决快速PCR的难题,博大泰恒公司投入巨大精力进行Taq酶的基因工程改造,于200...
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第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用--第一节 工具酶
...表示甲基化 三、分子克隆化的另一些酶 (一)DNA聚合酶 (DNapolymerase)的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物(primer)的3’-OH上,释放出一个焦磷酸分子(ppi),如下式表示。 聚合酶主要有以下几种: 1...
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影响结核杆菌PCR结果准确性的因素
自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来,该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点;但在临床应用时也遇到了不少问题,如假阳性、假阴性、污染等。如何去除影响结果准确性之因素,是国内外学者普...
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第三节 PCR操作范例及反应体系的组成
....01ng/次引物1,2(各25bp,20μmol/L)[3,4]5.01.0μmol/L(100pmol)Taq聚合酶储存液[2]0.52U/100μl总体积(pH8.3)100.0 石蜡油50~100.0 扩增条件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30个循环。 注:[1]反应缓冲液[10×]含:100mmol/lTris-HClpH8.3(25℃)...
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第九节 其它链扩增技术及应用范围
...,等.PCR技术的原理与应用.科学出版社.1992 7.朱平,等.PCR聚合酶链反应操作实验指南.科学出版社,1992 8.马立人,等.PCR技术的发展和文献,内部资料. 9.金冬雁,等译.分子克隆操作指南.科学出版社,1992 10.WangHC.PCRDESNandPCRDESNAf...
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豚鼠哮喘模型和哮喘患者气管上皮细胞内皮素-1和内皮素转化酶mRNA表达
【摘要】目的通过逆转录-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测豚鼠哮喘模型气管上皮内皮素-1(ET-1)mRˉNA表达,检测哮喘患者气管上皮内皮素-1(ET-1)和内皮素转换酶(ECE)mRNA表达。方法(1)动物实验部分:Hartley株豚鼠用卵蛋白...
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PCR检测方法
...乙二醇,DNA链间与链内的交联和DNA断裂等)均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点(0.13/碱基)在DNA分子上随机分布,一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点,那么,105个这样的分子...
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PCR引物设计的原则和要点
...体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点:1引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应...
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不同的样本处理方法对乙型肝炎病毒DNA检测的影响
【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)的聚合酶链反应(PCR)常规检测中血清样本的最佳处理方法。方法 分别用不同缓冲液(PBS与TE)对血清进行1:1或1:10稀释,不同浓度去污剂(TritonX-100与NP40)及巯基乙醇处理血清样本,以及用硫氰...
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分子生物学试验方法探讨四-PCR常见问题
...的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶...
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PSA基因扩增研究及其在核酸杂交中的应用
...n终止反应。 1.3.4DIG标记PSAcDNA和PSAcDNA的PCR扩增dTTP是DNA聚合酶、Taq聚合酶、末端转移酶和反转录酶的底物在PCR中,Dig-11-dUTP可以代替作为Taq聚合酶底物的dTTP。Dig-11-dUTP结合到PCR产物,不仅实现了Dig-11-dUTP对DNA的标记,而且能高...
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丙型肝炎病毒感染与肝细胞癌的相关性研究
...癌(HCC)的发生与丙肝病毒(HCV)感染的关系。方法应用聚合酶链式反应(PCR)对肝细胞癌(30例)和肝内胆管结石的肝组织(19例)的石蜡包埋标本中的HCV-RNA和HBV-DNA进行检测。结果肝癌组和结石组的HCV-RNA阳性例数分别为10例(...
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第三节 分子生物学实验诊断技术
...),即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物,在DNA聚合酶Ⅰ作用下,复制链延长。在ddNTP(2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸)存在下,复制延长随机受阻,形成分子量(长度)大小不等的片段。电泳分离,自显影,读图18-9分...
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深化学科交叉开发新型生物科研试剂
...学研究院有限公司开发。5.纳米PCR子课题:已开发出TrioDNA聚合酶商品,进入销售阶段。产品由苏州长三角系统生物交叉科学研究院有限公司开发。6.活性重组蛋白和RNAi拯救克隆子课题:包括500条人类、小鼠编码基因ORF表达克隆,...
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第三节 基因扩增技术(PCR)
第三节 基因扩增技术(PCR) 聚合酶链反应(polymerasechainreaction简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大...
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PCR实用技巧
...物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性。因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些...
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第五节 PCR各处应用模式
...②加热后cDNA与RNA链解离,然后与另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA,最后扩增靶DNA。 在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录,cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由于引物的高度选择性,细胞总RNA无需进行分级分离...
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金黄色葡萄球菌随机引物扩增DNA多态性的分型研究
...定的诊断标准。 3.工具酶及主要试剂:蛋白酶K、TaqDNA聚合酶及dNTPs均购自上海生物试剂公司。 4.DNA提取:500μlLB液体培养基增菌,加入25μl蛋白酶K,10%SDS10μl37℃温育1小时。酚、氯仿、异戊醇抽提,无水乙醇沉淀,溶解于5...
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尿嘧啶DNA糖基化酶在荧光定量PCR技术中的应用
...接裂解法。反应体系总体积50μl,其中反应酶混合物(Taq聚合酶2U,尿嘧啶DNA糖基化酶2μl)、PCR反应主混合液30μl、模板量20μl。使用ABIPRISMTM7700进行PCR荧光检测。反应参数:37℃保温10min后,94℃预变性5min,94℃变性10s,60℃退火60s...
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荧光定量聚合酶链反应测定乙型肝炎病毒DNA的应用价值
...杂志,2002,(25)5:318-320.2汲振余,赵翠林,孙爱民,等.聚合酶链反应作者:汲振余赵翠林陈洪涛陈茜巴秋菊
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极端微生物:不可估量的资源
...、能源利用等领域。“目前,已形成产业的主要是高温DNA聚合酶和一些洗涤品用极端酶,全球年产值都在数亿美元。”向华表示,在聚合酶链式反应(PCR)中,由于嗜热菌耐热DNA聚合酶“Taq”的使用,才使PCR的专一性、收得率、...
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胰腺癌p16基因mRNA异常表达的研究
我们应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰腺癌中p16基因mRNA的表达情况,同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)对其异常表达的原因进行分析,现将结果报道如下。 一、材料和方法 1.对象:新鲜胰腺癌...
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6-3-4癌基因及其产物的检测方法
...及载脂蛋白基因的分析等。 2、PCR-SSCP技术:PCR-SSCP是聚合酶链反应-单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism)的简称,原理是将经扩增的DNA片段经过变性处理,形成单链,由于序列不同,单链构象就有差异在中性...
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定量PCR技术
...利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标,没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标,不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C,这就使不同试剂盒之间的特...
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RAPD扩增分枝杆菌DNA优化条件及菌型分型的诊断应用
...条件为:50μl反应体系中,含100ng模板DNA,2.5mmol/LMgCl2,2UDNA聚合酶,引物0.5μmol/L,dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol/L,反应40个循环,每个循环为:94℃1min,36℃1min,72℃2min。所扩增结核杆菌临床分离株的DNA条带丰富、清晰,各条带差异...
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汉族人维生素D受体基因TruⅠ和FokⅠ多态性与腰椎间盘退变的关系△
...静脉血标本和腰椎MRI,其中对照组101例,病例组81例。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphism,PCRRFLP)法测定2组标本的VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位点多态性;根据MRI显示的信号差异按Schneiderman...
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表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定
...MgSO46mmol/L,4种dNTP各200mmol/L,5‘端引物0.2μmol/L以及TaqDNA聚合酶缓冲液,混匀后100℃加热5min。冷却至72℃加入TaqDNA聚合酶2U。PCR热循环条件:变性94℃持续30s,退火65℃持续30s,延伸72℃持续2min,共计30个循环;最后在72℃中延伸10mi...
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人FasL分子的克隆、表达及多抗制备
...学郭卯戊博士惠赠。 1.1.2 酶及其它试剂:Taq DNA聚合酶,限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ,T4 DNA连接酶等购自原平生物工程公司及华美生物工程公司;生物素标记羊抗兔IgG,亲和素标记HRP,生物素标记蛋白质标准分子量等均...
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毛细管电泳·激光诱导荧光检测分枝杆菌脱氧核糖核酸限制性内切酶谱
...分枝杆菌脱氧核糖核酸(DNA)限制性内切酶谱的新方法。用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439bp的片段,该扩增片段经限制性内切酶BstEII和HaeⅢ酶切后,分别用CE-LIFD装置和常规琼脂糖电泳(AGE)对比检测酶切片段。对P...