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PCR实用技巧
...步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件 a.足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b.GC%40%~~~~60%c.5‘端和中间序列要...
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PCR反应条件的选择
... 温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶...
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第四节 影响PCR的主要因素
...循环参数 在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30个循环,扩增片段500bp。在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的...
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HBVC区基因克隆和PCR条件优化
...NA,设计合适引物对HBVC区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2+浓度进行了优化,并比较三种不同TaqDNA聚合酶的灵敏度。结果转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2+浓度为1.5mM,同时确定天源公司的BiostarTaqDN...
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聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
...步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这...
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黄柏
...中之阴,降也。无毒。乃足少阴妙药,又入足太阳。专能退火解热,消渴最效,去肠风,止血痢,逐膀胱结热,治赤带,泻肾中相火,亦能平肝明目,其余《本草》所载功效,俱不可尽信也。盖黄柏乃至阴之物,其性寒冷,只可...
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PCR法检测阪崎肠杆菌的研究
...和敏感性。结果优化后的条件选择为:Mg2+浓度2.0mmol/l,退火温度60℃;PCR扩增后,出现469bp的产物,具有良好特异性;采用酚-氯仿法时,其最小检出量103CFU/ml菌液,热裂解法,为105CFU/ml菌液。结论优化的PCR检测阪崎肠杆菌条件,显...
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蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展
...结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。4.1.1配方的影响 配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%,那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中,药品微...
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结核分枝杆菌ERIC-PCR分型技术的建立
...热启动,PCR循环条件:97℃预变性10min,94℃变性1min,37℃退火2min,72℃延伸2min,共21个循环,随后94℃变性45s,58℃退火1min,72℃延伸2min,进行31个循环,72℃终延伸5min。取扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶(含0.5g/mlEB)中进行电泳(5V/cm)...
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补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化
...改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2+浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2+浓度在24mmol/L,引物浓度在0.0250.4μmol/L,循...
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RAPD扩增分枝杆菌DNA优化条件及菌型分型的诊断应用
...Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、靶DNA浓度、循环次数和退火温度下进行单引物扩增。 1.5RAPD-PCR产物检测2%的琼脂糖凝胶电泳后观察结果,用凝胶成像分析系统拍照保存。 2结果 2.1以H37Rv基因组DNA为模板,对引物反应条...
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婴幼儿奶粉中病原菌多重PCR检测研究
...两对引物各1.0μl,2U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl。然后,研究退火温度、Mg2+浓度和引物浓度等对PCR影响较大条件的优化。 1.2.4PCR扩增产物的电泳检测 取5μlPCR扩增产物加2μl上样液混匀,以DNAMarkerDL2000作相对分子质量指示,...
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第三节 放射性同位素标记核酸探针
...的重组质粒DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下,通过变性,退火和延伸过程,使探针DNA得到标记。反应在0.5ml离心管内进行,总体积为25μl,内含50mmol/lTris—HClpH7.5,10mmol/LMgCl2、BSa5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg连接的DNA或0.1μg质粒。反应...
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见形证治
...婴丹加紫草、牛蒡子、蝉蜕与服。热盛不退,以羌活散调退火丹进之,另用灯草、木通、蝉蜕、地骨皮煎汤候冷服。此用发表之剂,与表虚卫弱之说背驰,盖亦有初发热时见表证失于解散,实热壅遏而怒发者,此法犹可施也,然...
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见形证治
...婴丹加紫草、牛蒡子、蝉蜕与服。热盛不退,以羌活散调退火丹进之,另用灯草、木通、蝉蜕、地骨皮煎汤候冷服。此用发表之剂,与表虚卫弱之说背驰,盖亦有初发热时见表证失于解散,实热壅遏而怒发者,此法犹可施也,然...
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检测HBV基因组nt585位突变的特异性聚合酶链反应
...HBVDNA扩增特异性,参考文献[5]对影响PCR的因素(主要是退火温度)进行优化。 2 结果 2.1 寡核苷酸引物的序列与位置 分别针对adr和adw亚型HBVDNA设计了2套4对供msPCR扩增的寡核苷酸引物,其序列和位置如下。 P585RA:T...
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测序技术
...替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(500bp)得到清...
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手术操作与胃癌微转移的关系
...引物为1和2,扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,循环30次;最后72℃延伸5min。接着进行第二轮扩增,引物为3和2,扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,循环30次;最后...
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寡核苷酸的优化设计
...20%,而-10时,接近于0。虽然产量还取决于其他参数,如退火温度、引物的专一性等等,但是用Taq聚合酶操作时,由于它的工作能力很强,能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应,即使3′末端双链的稳...
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浅谈中药冻干粉成型的影响因素
...段,Tg与药品浓度有关;在干燥阶段,Tg与含水量有关。3.4 退火在冷冻干燥过程中的作用退火是指以一定的升温速度把冻结制品从冷却终温加热到低于其熔点的某一特定温度,并保持一段时间,然后再以一定的降温速率把制品冷却到冷...
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定点突变技术——从单点突变到多点突变
...设计一对包含突变位点的引物(正、反向),和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”,(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物,一圈后回到引物5’端终止,再经过反复加热褪火延伸的循环,这个反应区别于滚环...
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见形证治
...稠密,急用缠豆藤烧灰加制砂,连进三四服。或薄荷汤调退火丹进之,仍以牛蒡子为末,敷囟门上,以散热毒。非惟能使痘疏,且免侵眼之患。用缠豆藤烧灰为末,加入退火丹内,又用灯草、木通、蝉蜕、地骨皮煎,水调退火丹...
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见形证治
...稠密,急用缠豆藤烧灰加制砂,连进三四服。或薄荷汤调退火丹进之,仍以牛蒡子为末,敷囟门上,以散热毒。非惟能使痘疏,且免侵眼之患。用缠豆藤烧灰为末,加入退火丹内,又用灯草、木通、蝉蜕、地骨皮煎,水调退火丹...
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第二节 PCR技术的原理
...外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核...
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干湿
集之四·心脏部二痘疮上丹溪云∶疮干者宜退火,湿者宜泻湿。退火止用轻剂,荆芥、升麻、葛根、连翘之类。泻湿,乃肌表间湿,宜用风药防风、白芷之类。痘初起时,自汗不妨,盖湿热熏蒸而起故也。
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干湿
集之四·心脏部二痘疮上丹溪云∶疮干者宜退火,湿者宜泻湿。退火止用轻剂,荆芥、升麻、葛根、连翘之类。泻湿,乃肌表间湿,宜用风药防风、白芷之类。痘初起时,自汗不妨,盖湿热熏蒸而起故也。
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第二节 核酸(基因)探针目的核酸的制备技术
...发聚合反应,即双链DNA先高温变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应,重复这种循环反应可使DNA获得指数性倍增,例如经过35个循环反应,DNA...
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PCRTroubleshootingguide
...。如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下PCR仪或水...
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抗登革病毒3型单链抗体的基因克隆表达和免疫学鉴定
...A聚合酶(Promega公司)进行PCR扩增。条件是:94℃1分钟,55℃退火2分钟,72℃延伸2分钟,共进行35个循环,最后一个循环后72℃再延伸10分钟。分别从轻、重链可变区PCR扩增产物中取3μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,其余部分用MicrospinTM...
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PCR问题的总结
...要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅...