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感受态细胞的制备
...,37℃振荡培养1~1.5小时至对数生长期OD600=0.5左右。2、感受态细胞的制备⑴、将培养液1.5ml转入离心管中,冰上放置20分钟。⑵、置于4℃,5000rpm离心5分钟,倒尽上清。⑶、添加一半菌液体积(750ul)预冷的50mM的CaCl2,用枪轻...
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普...
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用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
...小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。 7用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中,加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻旋以混匀内容物,冰浴30min; 8将离心管放到预加温到42℃的水...
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用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
...杆菌菌株,并且比方案I快速,重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。 1)从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个...
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第二十四章 DNA的克隆与序列测定--第一节 DNA的克隆
...应结束时,取1~5μl上述反应混合物转化200μl的大肠杆菌感受态细胞,即可将外源DNA与载体接连起来。 二、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷...
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分子生物学试验方法探讨四-PCR常见问题
...的片段,还需要作什么对照实验? A)涂布未转化的感受态细胞。如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。 B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。例如,将1ug/ul质...
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金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因克隆
...PmD-18T载体1μl,solution5μl共10μl,于15℃过夜。取5μl转化感受态细胞。1.2.4感受态细胞的制备和转化方法将JM109LB培养基于37℃摇床培养过夜,然后按第三版《分子克隆实验指南》中的方法操作。1.2.5DNA序列测定将6个阳性克隆同时以...
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NCLs致病相关基因CLN8酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用的检测
...鉴定,用DNA测序仪进行测序(上海生工公司)。1.2.3酵母感受态细胞的制备从SD/-U平板上挑取单个EGY48(P8OP-LacZ)酵母克隆至1mlSD/-U液体培养基中,高速振动打散细胞,将上述含酵母细胞的培养液转移至50mlSD/-U,30℃、250rpm、孵育18...
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大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定
...;lTE(含RNAse20μg/ml)中,震荡混匀,-20℃保存备用。1.2.3感受态细胞的制备(氯化钙法)[4]从37℃过夜培养的大肠杆菌平板中挑取单一菌落,转至2mlLB液体培养基中,37℃、震荡培养过夜。取培养物1:40稀释到新鲜LB液体培养基...
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人碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析
...纯化的bFGF基因与pcDNA3.1(+)载体片段连接,转化E.coliDH5α感受态细胞,制备表达质粒;酶切鉴定筛选重组质粒,筛选出的重组质粒进一步测序鉴定。质粒DNA的制备、片段回收、酶切、连接、转化,参照文献[3]进行。1.2.5重组质...
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诺瓦克病毒ORF1-ORF2序列核酸片段克隆的构建
...内切酶购自NEB公司;引物由上海基康生物有限公司合成;感受态细胞购于东正汇东生物公司;毒株分离自中国疾病预防控制中心提供的诺瓦克病毒检测阳性的粪便悬液。1.2方法1.2.1病毒RNA的提取腹泻标本以12000r/min离心10min后,取...
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芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建
...ATCC细胞库;GM2163(Dam-Dcm-)由NEB北京总代理公司赠送;HB101感受态细胞购于北京经科宏达有限公司。 1.1.2酶及主要试剂TakaRaLATag酶,TakaRaT4DNA连接酶,购自北京六合通生物技术有限公司;TOPOTMTACloningKits购于invitrogen公司;脑心浸液购...
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HBV相关肝细胞癌患者HBVX基因变异的分析
...ndⅢ(均购于Takara大连公司),胶回收试剂盒;大肠杆菌Top10感受态细胞,pBS-T质粒载体试剂盒,质粒小量抽提试剂盒(均购于北京天为时代公司)。1.3引物参照GeneBank中HBV基因组相应区域保守序列设计引物正向:GGAGCTCATCATTTCCATGGCTGCTCG...
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第五节 基因序列导入细胞
...方法处理细胞,经处理后的细胞就容易接受外界DNA,称为感受态细胞,再与外源DNA接触,就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理,就成为感受态细菌,当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理,质粒DNA就能...
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变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建
...pUC19,构建luxS基因缺失的重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞经筛选后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定。结果变链菌国际标准株可诱导哈氏弧菌BB170的生物发光现象,提示变链菌中存在AI-2数量感应通路。构建的重组质粒pUCl...
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CLN8P与ND1相互作用的鉴定
...振摇至OD600=0.5±0.1,转移此菌液至50ml离心管。 2.4酵母感受态细胞转化在每一1.5mlEP管中加入100μl制备好的感受态细胞,0.1mgcarrierDNA,再分别加入阳性克隆质粒,CLN8质粒,阴性对照质粒(空pLexA载体),阳性对照质粒(plexA-Pos...
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医学遗传学实验指导
...配制四、染液的配制五、其他常用试剂的配制六、高效率感受态细胞的制备七、一些特殊实验中缓冲淮的配制编辑推荐:作者:http://www.dangdang.com/product/8908/8908791.shtml
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生物化学与分子生物学实验教程/面向21世纪课程教材
...DNA的微量制备实验9 质粒DNA的微量制备实验10 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA分子导入受体细胞实验11 蛋白质高效液相色谱氨基酸组成分析实验12 亲和层析纯化乳酸脱氢酶实验13 固相pH梯度IEF-SDS蛋白质组驿向凝胶电泳分析...
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分子生物学实验技术
...:目录:实验1质粒DNA的提取、酶切与鉴定实验2大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA分子导入原核细胞实验3DNA重组实验4植物基因转化实验5有ExoⅢ外切酶构建亚克隆实验6PCR基因扩增实验7噬菌斑的形成及单链DNA的提取制备实验8DNA...
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抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段
...A片段的消减混合物,与pEASYT3克隆载体连接并转化到TP10感受态细胞中,构建多耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库。结果耐药株与敏感株间差异片段大量富集,得到大小200~1500bp弥散状DNA条带;将这些差异DNA片段富集后构建成消减...
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制备高效率感受态的方法
...。 以下为转贴,具体方法请最好查阅文献。 E.coli感受态细胞制备方法: 单菌落平板至2mlLB,37oC250r/movn,1ml转至50mlLB,37oC250r/m至A600 =0.2-0.4 离心后用10毫升TSS重悬后,分装-70oC保存。尽量冰上操作. 转化:加质粒(5...
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医学细胞生物学与遗传学实验教程
...培养细胞的分裂指数和集落形成率的测定实验二十二E.coli感受态细胞的制备和转化实验二十三应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本实验二十四酶联免疫吸附测定法实验二十五显微摄影技术实验二十六体外培养细胞的转化实...
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人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达
...离、纯化回收。经T4DNA连接酶连接过夜,转化E.coliDH5α感受态细胞,涂布于含卡那霉素的LB培养板上,37℃培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进行NdeⅠ、HindⅢ双酶切及PCR电泳鉴定,筛选出的重组质粒进一步测定目的基...
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hTERT激活人骨髓间充质干细胞端粒酶活性
...化和鉴定挑取生长良好的大肠杆菌DH5α单菌落制备为感受态细胞,取50μl感受态细胞,加2μl质粒pCIneohTERT溶液进行细菌转化,过夜后挑取单菌落,接种于含氨苄青霉素的LB培养液进行质粒的扩增,按试剂盒说明书提取并纯...
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食品和水源微小隐孢子虫18SrRNA鉴定方法研究
...片段与PGM-T载体连接,16℃过夜,转化宿主菌BL-21,同时作感受态细胞空白对照。 1.2.5重组菌液的PCR鉴定和质粒的酶切鉴定将转化后的菌液涂布于含有Amp的LB固体选择培养基,同时设感受态细胞的Amp-空白对照(A组)和Amp+空白...
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反复冻融对荧光实时定量PCR质粒标准品的影响研究
...团。 1.2方法 1.2.1重组质粒的克隆取40μlDH5α感受态细胞,加入2μl所赠质粒母液并混匀,冰浴30min后,于PCR仪上42℃热激90sec,迅速置于冰上冰浴2min。将混合液接种到800μlSOC液体培养基中,37℃,<225rpm摇菌1.5h。取含A...
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HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备
...TC-200PCR仪上94℃10min,94℃10s,60℃30s,循环45次。 1.2.3感受态细胞的制备用CaCl2制备感受态大肠杆菌[2]。 1.2.4AT亚克隆[3](1)连接电泳检测PCR产物,对照Marker估算DNA浓度,将剩余PCR产物无需纯化,直接使用pBS-T连接试...
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定点突变技术——从单点突变到多点突变
...针对大于8Kb的质粒的定点突变的,通过优化试剂特别是其感受态细胞(XL10-Gold),使得较大的质粒的定点突变也一样简单。QuikChange由于操作简单快速,效率高(80%)而受到普遍欢迎,光是今年的前9个月就有超过400篇发表的论文...
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BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达
...得pUC18-Fcγ1700重组克隆载体。上述重组克隆载体转化DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。小提质粒后,分别用EcoRⅠ、EcoRⅠ/HindⅢ、HindⅢ/BamHⅠ处理进行酶切分析;再用PstⅠ、EcoRⅠ/PstⅠ、SmaⅠ处理进行酶谱鉴定。...
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SARS冠状病毒E蛋白基因克隆和分析
...公司)纯化后与pUCm-T(Biobasic公司)连接并转化E。coliJM109感受态细胞,蓝白筛选阳性克隆,重组质粒用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后经6%PAG凝胶电泳鉴定。1.5序列的测定及蛋白质结构分析将酶切鉴定的阳性克隆委托上海三博生物技术有限...