乳糜微粒

化验及医学检查

心气虚,则脉细;肺气虚,则皮寒;肝气虚,则气少;肾气虚,则泄利前后;脾气虚,则饮食不入。
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1 拼音

rǔ mí wēi lì

2 英文参考

CM

chylomicron

3 概述

乳糜微粒(CM)是饮食高脂肪食物后,由肠壁细胞合成的富含TG的巨大脂蛋白,80-100nm。乳糜微粒是人血浆中最大的脂蛋白颗粒。血中半寿期为10~15分钟,食后12小时,正常人血中几乎无CM。脂蛋白电泳时CM位于原点,需注意的是做血清脂蛋白电泳样品应新鲜,不可冻存。乳糜微粒在肠上皮细胞合成,并分泌入淋巴管淋巴CM(初级颗粒)进入血浆时丢失APOA而获得APOC和E形成次级CM,APOCⅡ是LPL激活剂。CM在LPL作用下脱去TG形成表面残基和核心残基。核心残基转入肝细胞,其脂类用于VLDL合成,表面残基中的APOC、FC和磷脂则转入盘状HDL。CM含有ApoAⅠ,AⅡ,AⅣ和B48。ApoB48含量多少与摄取食物的TG含量有关。ApoB48是合成CM所必须的蛋白质,CM从胸导管移行入血液过程中,其载脂蛋白的组份迅速改变。CM获得ApoC和E后,将ApoAⅠ移行到HDl,脱去ApoAⅣ,使进入血中的CM被末梢血内皮细胞表面的LPL经ApoAⅡ激活,并作用于其内的TG,分解变成脂肪酸和单甘油脂肪酸,再进入肌肉脂肪组织心肌组织贮存或利用。CM表面的磷脂和Apo往HDL3移行,颗粒变小,结果转变成CM残粒,分别被肝脏LDL受体和清道夫受体识别并摄取。

CM生理功能是转运外源性脂类,主要是甘油三酯。其中TG在毛细血管中被水解成游离脂肪酸后进入各组织贮存或利用,而外源性胆固醇则全部进入肝。

4 乳糜微粒医学检查

乳糜微粒是人血浆中最大的脂蛋白颗粒,CM是多数膳食TG从小肠吸收部位输送至体循环淋巴CM(初级颗粒)进入血浆时丢失APOA而获得APOC和E形成次级CM,APOCⅡ是LPL激活剂。CM在LPL作用下脱去TG形成表面残基和核心残基。核心残基转入肝细胞,其脂类用于VLDL合成,表面残基中的APOC、FC和磷脂则转入盘状HDL。CM清除速度快,半衰期为10min,正常人空腹12h后不能检出,脂蛋白电泳时CM位于原点。需注意的是做血清脂蛋白电泳样品应新鲜,不可冻存。

4.1 分类

血液生化检查 > 脂类测定

4.2 化验取材

血液

4.3 原理

(1)免疫透射比浊法血清CM与试剂中的特异性抗人CM抗体相结合,形成不溶性免疫复合物,使反应液产生混浊,以光度计在波长340nm测出吸光度,代表混浊程度,浊度高低反映血清标本中CM的含量,后者可由校准血清所作校准曲线读出。

试剂中聚乙二醇(PEG)有促进抗原抗体反应作用。CM主要存在于HDL颗粒表面,血清稀释及表面活性剂有助于HDL CM抗原位点暴露,使之能充分地与特异性抗体反应表面活性剂还可减轻血清空白浊度。

(2)火箭电泳法:火箭免疫电泳法是单向免疫扩散法的一种改进,通过应用直流电(稳压稳流)使抗原(CM和B)在含有特异性抗体琼脂凝胶扩散,pH 8.6时抗原向阳极移动,在泳动途中与凝胶中的抗体反应,逐渐形成类似火箭的沉淀峰。其峰高(或峰面积)与抗原浓度成正比,故可作抗原定量。

4.4 试剂

(1)免疫透射比浊法

样品稀释剂:pH 7.4的磷酸缓冲液(0.01mol/L磷酸盐中含0.15mol/L氯化钠),内含PEG-6000 40g/L及表面活性剂适量(选用聚氧乙烯月桂醚类,如Thesit或Tween-20),用GS玻芯漏斗抽滤后用。本试剂的吸光度A340nm<0.05,在2~6℃冰箱中可存放半年。如半年后A值仍<0.05,可继续应用,如>0.05可按上述条件抽滤后再用。

②羊或兔抗人apoAⅠ抗血清:原血清效价以1∶32~1∶64为宜。抗血清可用含PEG-6000的磷酸缓冲液(不含表面活性剂)或用硫酸铵沉淀法纯化。抗血清应用液浓度因各批抗血清效价免疫亲和力而异(应按试剂盒介绍,临用前稀释)。抗血清中含防腐剂,在2~6℃冰箱中可存放半年。原血清(冻干)在低温冰箱中(-20℃以下)可贮存数年。

③参考血清:现在已有国际标准,即WHO CM参考物质SPI-01(冻干血清)。符合国际标准的校准血清由卫生部北京老年医学研究所提供。

校准血清保存在-20℃以下,至少稳定半年,化冻后必须彻底混匀后才能应用。最好备有高、中、低浓度(例如apoAⅠ 2.0,1.3与0.6g/L左右)的校准血清各1份。便于作校准曲线

附注:

①关于抗血清:比浊测定与其他方法比对抗血清的要求更高。比浊法以用多克隆抗体为宜。抗血清中必须不含杂抗体。必须十分重视从人血清中提取的apoA-Ⅰ达到免疫纯、色谱纯与电泳纯,这不是一般实验室都能做到的。抗血清效价(滴度)不可低于16。目前国内某些商品试剂中,apoA-Ⅰ抗血清效价极低,选购试剂盒时必须注意。如果没有在选购前鉴定抗血清质量的经验,应请有条件的单位鉴定之。

②上法中标本血清)稀释200倍是为了便于手工操作(加样100μl),如有精密加样器,可作20倍稀释(用10μl)。为了适合不同实验室的条件(如不同类型的自动化仪器),作适当修改时应注意抗原抗体的比例,必须十分注意反应体系中不可有抗原过量,线性上限不可低于2.5g/L。换言之,抗血清用量必须充裕,否则标本中apoA-Ⅰ高水平时测出结果偏低。目前国内某些商品试剂盒不但抗血清效价过低,操作中所定标本用量又过大(如3~5μl),抗体明显不足,测出结果必然不准确。

③为了达到准确测定的目的,apoA-Ⅰ与B比浊测定(终点法)中必须作校准曲线计算结果。一定范围(低标本用量)浓度(X)与浊度(Y)基本上成直线关系,直线回归计算出在Y轴上有一定截距(A值<0.1),所以用单点校准计算结果偏差较大,使测出结果不能准确反映浓度的高低(高的偏低,低的偏高)。千万不要因为单点法简便而忽略了测定的准确性。无论用何种自动化仪器,必须先试作校准曲线。如果在所用仪器及特定条件下反复测试,回归线的截距不明显时,才能采用单点校准法。标本用量在3~5μl时,即使加大抗血清用量,浓度与浊度也不成直线关系,只能用曲线直线化转换后计算。

④主要干扰因素是血清本身的混浊(如高脂血清),用超离心脂肪酶水解等标本预处理方法都不实用。用表面活性剂消浊作用也有限,所以在测定中必须作标本空白管。除了自动分析中可采用两点法外,手工法用单一试剂而不扣除标本空白的做法是错误的。为了减少基质效应对浊度反应的影响,必须用定值血清校准物。此外,尘埃粒子、比浊皿划痕等干扰也必须排除。

⑤有的商品试剂盒(包括某些进口产品)所附校准血清定值不准确,是误差的重要来源。

(2)火箭电泳法

①巴比妥缓冲液离子强度0.05,pH8.6。

②10g/L琼脂糖(标准电内渗)用巴比妥缓冲液配制,加热溶化,混合后,分装10ml/管,冷后4℃贮存。

③0.15mol/L NaCl溶液。

④兔(或羊)抗人apoAⅠ抗血清效价不低于1∶16)及apoB抗血清效价不低于1∶32)。

校准血清(同比浊法)。

⑥染色液:考马斯亮蓝R-250 0.25g溶于甲醇45ml中,加入冰醋酸10ml及水45ml,混合,溶后备用。

脱色液:每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。

4.5 操作方法

(1)免疫透射比浊法

标本应是及时分离的空腹血清,可密封存放在2~6℃冰箱中,1周内测定,-20℃可存放半年。

②用全自动分析仪时,应根据不同仪器设计参数,合理选择抗原抗体比例及反应时间。也可作速率法散射比浊测定CM如用Beckman比浊仪ICS或protein array system)。

③手工法所用仪器:精密光度计,具有340nm滤光片(或分光器),样品池体积以0.5ml为宜(为节省抗血清),最好用流动杯,样品稀释最好用稀释器、经校正的加样器。

标本处理:将血清标本质控血清各用样品稀释剂作1∶200稀释,即先作1∶20稀释(5.Oμl血清+95μl稀释剂)后,再作1∶10稀释(多余的1∶20血清作测定apoB用)。然后按表1操作。

质控同上处理。

混匀后,25~37℃放置30min,在波长340nm比浊,根据U-UB的A值,在标准曲线上读出结果。

本法批间CV<5%。

校准曲线:在手工与半自动操作中每批测定均需作校准曲线,可将校准血清稀释成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4种浓度,与标本同样操作,根据定值计算出每个标准管CM浓度,以浓度(X)与其相应的A值(Y)作图(用直线回归计算),基本上成直线,但在Y轴上有一定截距,所以不能用单点标准。操作准确时浓度与A值的相关系数应在0.985以上。

如有高、中、低浓度的三份校准血清时,可与标本同样操作,做三点定标,也可作五点定标(即高、中浓度的血清等量混合,及中、低浓度的血清等量混合,成为另两份校准血清)。

本法线性范围:0.4~2.5g/L。

(2)火箭电泳法

①浇板:每板用10g/L琼脂糖10ml,沸水浴中融化,混匀,冷至50~55℃时加入CM抗血清50μl,apoB抗血清8μl(用量视抗血清效价而定),迅速混匀后倒在预置在水平台上的玻璃板上,冷后放在4℃,20min后打孔,孔在板的阴极端,孔径3mm,孔间距至少5mm,孔容量5μl。把板放入电泳槽,用滤纸搭桥

②稀释抗原:用0.15mol/L NaCl液将校准血清稀释成1∶100,1∶150,1∶200,1∶300,及1∶400(作校准曲线之用),血清标本按1∶200稀释,放4℃冰箱不得超过3天。

③加样:在低电流状态(10mA/板)将稀释好的定值血清标本分别吸取5μl(准确),加入琼脂凝胶加样孔内。每板都要做一系列标准。

④通电:稳流24mA/板,端电压6~8V/cm,以流水冷却使琼脂保持15℃,电泳3~4h。

⑤脱杂蛋白及制干胶膜:电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min,将胶膜托置于聚酯薄膜上,用多层滤纸在轻轻加压下吸干胶内水分然后将滤纸、胶膜与聚酯膜三者一起自然干燥,或用热吹风器吹干,干后胶膜会自然与滤纸及聚酯膜分开。

⑥染色:将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20~30min。

脱色:用脱色浸泡已染色的胶膜至火箭峰清晰,背景基本无色。可在水中用两片玻璃纸将胶膜夹住,晾干后可长期保存。也可以用流水浸泡脱色至背景干净。

附注:

抗原稀释倍数与抗血清用量的选择,应以火箭峰清晰、校准曲线斜率适中并成直线为宜。本法同时测定apoA-Ⅰ与apoB,应调整两种抗血清用量,使二者峰高有区别,apoB峰高不小于1cm。

②不同种类来源的抗血清(如兔与羊),在等效价的情况下进行试验,结果会有差异。apoA-Ⅰ测定以兔抗血清为好。用兔血清时峰形尖细,而羊血清所产生的峰粗,峰尖圆钝,有时在峰顶前出现虚影。校准血清所作校准曲线斜率也不同。但不论用何种抗血清,定量结果差别不大。

③在一定条件下电泳,不同稀释度校准血清的峰高不会有明显变动,校准曲线斜率基本一致。如标本峰高超出校准曲线范围时,应调整标本稀释倍数后重测。板间CV通常小于5%。

④火箭电泳结果可以用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰。前者用标本少,节省抗血清,但如适当增加标本抗血清用量,不染色更为方便。所用琼脂糖应为标准电渗或低电渗的,凝胶中加入适量葡聚糖聚乙二醇可使火箭峰更清晰。

⑤火箭峰的测量可以计算面积或峰高,面积是峰高乘以峰宽(峰半高处的宽度)。测量精度最好能达0.1mm。须用机械或电子放大设备。标准曲线范围内峰高以1~4cm为宜。

⑥本法适用于少量标本分析。也适用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)测定。

4.6 正常值

阴性

4.7 临床意义

阳性高脂蛋白血症Ⅰ型高脂蛋白血症Ⅴ型

4.8 相关疾病

高脂蛋白血症Ⅰ型     高脂蛋白血症Ⅴ型

编辑:banlang 审核:sun
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