3 基本信息
ICS 11.020
C 61
中华人民共和国卫生行业标准WS/T 632—2018《巴贝虫检测血涂片镜检法》（Detection of Babesia spp.——Blood smear microscopy examinationmethod）由中华人民共和国国家卫生健康委员会于2018年09月26日《关于发布〈土源性线虫病的传播控制与阻断〉等6项推荐性卫生行业标准的通告》（国卫通〔2018〕21号）发布，自2019年04月01日起实施。
4 发布通知
关于发布《土源性线虫病的传播控制与阻断》等6项推荐性卫生行业标准的通告
国卫通〔2018〕21号
现发布《土源性线虫病的传播控制与阻断》等6项推荐性卫生行业标准，编号和名称如下：
WS/T 630—2018 日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验
WS/T 631—2018 日本血吸虫毛蚴检测 尼龙绢袋集卵孵化法
上述标准自2019年4月1日起施行。
特此通告。
国家卫生健康委员会
2018年9月26日
5 前言
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、第二军医大学、中国农业科学院上海兽医研究所。
本标准起草人：张仪、周晓农、刘琴、陈韶红、朱淮民、周金林。
6 标准正文
6.1 1 范围
6.2 2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
WS/T 564 巴贝虫病诊断
6.3 3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
巴贝虫 Babesia spp.
一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（Babesiosis）。感染人体的巴贝虫有田鼠巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani)和猎户巴贝虫(B. venatorum)等。
3.2
血涂片 blood smears
将血液涂制于载玻片上制成的涂片, 分为厚血膜涂片和薄血膜涂片。
6.4 4 仪器和器材
4.2 血涂片染色架
4.4 玻片盒
4.5 染色盘和染色缸
4.6 计数器
6.5 5 试剂和材料
5.1 吉氏染色原液（Giemsa)
5.3 标准级载玻片（洁净载玻片，或表面带正电荷的粘附玻片）
5.6 二甲苯 （分析纯）
5.7 甘油
6.6 6 检测步骤
6.6.1 6.1 血涂片的制作
6.6.1.1 6.1.1 采血部位及取血方法
末梢（无名指指尖或耳垂）取血。用75％酒精棉球消毒取血部位，待酒精挥发后，用拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，另一只手手持一次性采血针迅速刺入皮肤，轻轻挤压出血。婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
6.6.1.2 6.1.2 厚血膜制作
取 1张已消毒的载玻片（或粘附玻片）作推片，用推片的一角，取 4µL～5 µL的血量，使血与另1张平置的载玻片（或粘附玻片）中央偏右的位置接触，由里向外旋转，画 2 圈～4 圈，涂成直径0.8cm～1 cm大小圆形厚血膜（见附录A）。
6.6.1.3 6.1.3 薄血膜制作
干棉球抹净推片下角的血渍，用同一张推片中部取约 1 µL~ 1.5µL的血量。将血置于离厚血膜左边缘约 0.3 cm 的位置，推片的边缘紧贴载玻片，上下轻轻移动，使血沿推片的边缘散开至2cm宽，使两张玻片保持 25°～35°角，从右向左迅速推动推片向前，推成舌状薄血膜（见附录A）。
6.6.1.4 6.1.4 编号
血涂片制好后水平放置，充分干燥后，在玻片一侧毛玻璃上或在靠近厚血膜一端边上标注编号和日期。
6.6.2 6.2 固定与溶血
6.6.2.1 6.2.1 薄血膜固定
将薄血膜一端朝下呈 45°角，用一次性吸管吸取甲醇溶液，均匀轻抹于薄血膜表面，避免碰触厚血膜。
6.6.2.2 6.2.2 厚血膜溶血
在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟，待血膜呈浅灰色，倾去溶血血液。
6.6.3 6.3 吉氏染色
6.6.3.1 6.3.1 吉氏染液的配制
常用的吉氏染液工作液包括 2%、3%、10% 三种浓度，分别由吉氏染液原液和pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）按比例配制，也可购买商品化吉氏染液原液加实验用纯水按比例配制（见附录B）。
6.6.3.2 6.3.2 吉氏染色
染色方法见附录B
6.6.4 6.4 显微镜检查
在染色后的血涂片上加 1滴香柏油或专用浸油，用 100×（倍）油镜、10×（倍）目镜的光学显微镜检查。观察血片路线顺序为薄血膜从尾部舌尖部分开始，厚血膜从上端或下端开始（见附录A）。
6.6.5 6.5 结果判定
6.6.5.1 6.5.1 巴贝虫检测阳性
6.6.5.2 6.5.2 巴贝虫染虫率计数
6.5.2.1 薄血膜的巴贝虫染虫率计数法
显微镜下检查薄血膜，计数每个视野中的染虫红细胞和红细胞总数2 000 个以上。用下式计算巴贝虫染虫率。
6.5.2.2 厚血膜的巴贝虫染虫率计数法
若染虫率低于 0.1％时，显微镜下检查整张厚血膜片，计数整张厚血膜片的巴贝虫虫体数和红细胞总数。用下式计算巴贝虫染虫率。
8 附录B（规范性附录）试剂配制与血涂片染色、保存方法
8.1 B.1吉氏染色原液配制
将 5.0 g 吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至250 mL 甘油加完为止，倒入 500 mL 有塞深色玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至 250 mL 甲醇洗净研钵中甘油为止。置室温内，避免阳光直射。塞紧瓶塞，避免蒸发和高湿造成的氧化。每天用力摇动溶液 5 min，3 d 后即可使用，储存时间越久染色效果越佳。根据日常的需求，用干燥吸管吸取少量的染色原液到密闭的分装瓶中（大约 25 mL）。切勿向原液中加入水。
8.2 B.2 pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
称量 8.0 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4（或者 1.44g Na2HPO4）和1.8 g K2HPO4，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的 pH值至 7.2，最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃冰箱中备用。
8.3 B.3吉氏染色工作液配制
B.3.1 2％ 吉氏染液工作液的配制
在 98 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 2 mL吉氏染色原液并混匀，或98 mL实验用纯水中加入2mL商品吉氏染色原液并混匀。
B.3.2 3％吉氏染液工作液的配制
在 97 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 3 mL吉氏染色原液并混匀，或97 mL实验用纯水中加入3mL商品吉氏染液原液并混匀。
B.3.3 10％吉氏染液工作液的配制
在 90 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 10 mL吉氏染色原液并混匀，或90 mL实验用纯水中加入10 mL商品吉氏染液原液并混匀。
B.3.4 注意事项
吸取吉氏染色原液时切勿摇晃盛染色原液瓶子。吉氏染色工作液应现用现配，切勿将未用完的吉氏染色工作液倒回原液瓶中。
8.4 B.4 单张血涂片染色法
单张血涂片吉氏染色常用于临床巴贝虫病患者的巴贝虫显微镜检测。采用3％吉氏染液染色30min或更长时间。该染色法染色的血涂片可长期保存。也可采用 10％吉氏染液染色8 min～10min，但该染色法染色的血涂片不适合长期保存。
8.4.1 B.4.1 3％吉氏染液染色法
B.4.1.1. 把经甲醇固定的薄血膜涂片充分干燥后，血膜面朝上水平放置在染色盘中。
B.4.1.2. 用吸管吸取新配制的 3％吉氏染液 3 mL 左右，滴加于厚、薄血膜上，至染液均匀覆盖血膜，不溢出为止。
B.4.1.3. 静置染色约 30 min。
B.4.1.4. 将染色盘移至冲水池，用缓慢流水沿血涂片上缘冲洗 1 min。B.4.1.5. 将染色后的血涂片血膜面朝下插入血片干燥架，晾干。
8.4.2 B.4.2 10％吉氏染液快速染色法
B.4.2.1. 把经甲醇固定的薄血膜涂片充分干燥后，血膜面朝上水平放置在染色盘上。
B.4.2.2. 用吸管吸取新配制的 10％吉氏染液约 3 mL，滴加于厚、薄血膜上，至染液均匀覆盖血膜，不溢出为止。
B.4.2.3. 静置染色 8 min ~10 min。
B.4.2.4. 将染色盘移至冲水池，沿血涂片上缘用缓慢流水冲洗 1 min。
B.4.2.5. 将染色后的血涂片血膜面朝下插入血片干燥架，晾干。
8.5 B.5 成批血涂片染色
成批血涂片染色常用于人群流行病学调查中的巴贝虫显微镜检测，一般采用2％吉氏染液进行批量血涂片染色。
B.5.1. 将每张血涂片的血膜朝一个方向插入染色缸中，或将每对血涂片的血膜朝外插入染色缸中。
B.5.2. 倒入新配制的 2％吉氏染液浸没厚、薄血膜。
B.5.3. 静置染色 30 min以上。
B.5.4. 向染色缸中注入自来水至溢出，除去染液表面浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入自来水，缓慢冲洗 2次 ～3 次。
8.6 B.6 血涂片保存
用吸水纸吸去已检血涂片血膜表面的香柏油，在血膜上滴加 2 滴～3 滴二甲苯，然后用吸水纸吸干。置血涂片于玻片盒内，避光、干燥和阴凉保存，以备复核。注意：专用浸油无需用二甲苯清洗，可直接用吸水纸吸干。
9 附录C（资料性附录）形态学
9.1 C.1 形态
巴贝虫在红细胞内寄生时形态具有多样性。常见虫体形态有环形、圆形、杆形、点状、梨形、阿米巴形等。典型形态为梨形，往往在一个红细胞内有多个虫体寄生，以 1个～4个虫体居多，可形成三联体或四联体型，即马尔他十字形，且可为不同发育时期的虫体。经吉氏染色后，胞浆呈蓝色，核呈紫红色。
图C.1 薄血膜片中田鼠巴贝虫
图C.2 薄血膜片中分歧巴贝虫（引自Mørch K, Holmaas G, Frolander, et al. Severe humanBabesiadivergens infection in Norway. Int J Infect Dis, 2015, 33:37-38）
图C.3 薄血膜片中邓肯巴贝虫
图C.4 薄血膜片中猎户巴贝虫（引自Sun Y, Li SG, Jiang JF, et al. Babesia venatorum Infectionin Child, China. Emerg Infect Dis, 2014, 20(5):896-897）
10 参考文献
[1] 刘恩勇，赵俊龙. 巴贝斯虫病（第一版）[M]．武汉：湖北人民出版社2001，21-30．
[2] 吴观陵．人体寄生虫学（第4版）[M]．北京：人民卫生出版社，2013，233-237．
[4] Zhou X, Xia S, Huang JL, et al. Human babesiosis, an emerging tick-borne disease in the People’sRepublic of China[J]．Parasites & Vectors 2014, 7:509．
[5] Mørch K, Holmaas G, Frolander, et al. Severe human Babesia divergens infection in Norway[J]．Int JInfect Dis, 2015, 33:37-38．
[6] Sun Y, Li SG, Jiang JF, et al. Babesia venatorum Infection in Child, China[J]．Emerg Infect Dis, 2014, 20(5):896-897．
[7] WS/T 564 巴贝虫病诊断．
