WS/T 594—2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法

中华人民共和国卫生行业标准 卫生标准

心气虚,则脉细;肺气虚,则皮寒;肝气虚,则气少;肾气虚,则泄利前后;脾气虚,则饮食不入。
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1 拼音

WS/T 594—2018 yíng lèi kàng yào xìng jiǎn cè fāng fǎ jiā yíng bù mǐn gǎn yǐ xiān dǎn jiǎn zhǐ méi děng wèi jī yīn jiǎn cè fǎ

2 英文参考

Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica

3 基本信息

ICS 11.020

C 05

中华人民共和国卫生行业标准WS/T 594—2018《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测法》(Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica)由中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会2018年3月1日《关于发布推荐性卫生行业标准〈蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测法〉的通告》(国卫通〔2018〕3号)发布。该标准自2018年8月1日起施行。

4 发布通知

关于发布推荐性卫生行业标准《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测法》的通告

国卫通〔2018〕3号

现发布推荐性卫生行业标准《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测法》,编号和名称如下:

WS/T 594—2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测

该标准自2018年8月1日起施行。

特此通告。

国家卫生计生委

2018年3月1日

5 前言

本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准主要起草单位:中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。

本标准主要起草人:邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩。

6 标准正文

蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测

6.1 1 范围

本标准规定了家蝇不敏感酰胆碱酯酶等位基因检测方法

本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型检测

6.2 2 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

6.2.1 2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase

存在于生物体的一种水解酶,由乙酰胆碱酯酶基因ace编码

6.2.2 2.2 等位基因 allele

存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因

6.2.3 2.3 342G、342V 和 342A

342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)。

6.3 3 样本采集

采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内,浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在4 ℃条件下短期(6个月内)保存,可在-20 ℃以下长期保存

6.4 4 引物

引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC,引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附录A。配制为10 μmol/L浓度,保存于-20 ℃冰柜。

6.5 5 仪器设备

5.1 PCR(聚合酶链式反应)仪。

5.2 琼脂凝胶电泳仪。

5.3 凝胶成像仪。

5.4 恒温水浴锅。

6.6 6 主要试剂

6.1 DNA聚合酶(Taq酶)。

6.2 限制性内切酶Bsp1286I。

6.3 限制性内切酶Eae I。

6.7 7 操作步骤

7.1 在 PCR 管中加入 10×PCR 缓冲液 (含 100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2) 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL,引物 F 0.5 μL,引物 R 0.5 μL,单头家蝇的基因组 DNA 1 μL(100 ng~300 ng,提取方法可参见附录 B,也可用商售的 DNA 提取试剂盒或其他类似方法提取)和 Taq酶 (2~5 个单位),用灭菌水补齐至 25 μL,混匀。

7.2 将 PCR 管放入 PCR 仪中,设置 PCR 反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃30 s,35 个循环;72 ℃ 10 min。运行程序

7.3 PCR 运行结束后,取 5 μL PCR 产物在 1.5% 的琼脂凝胶上进行电泳,电压设定在 160 V,电泳20 min 后在紫外光下检测,有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR 产物用于进行以下酶切反应

7.4 取合格样品(即电泳检测产物为 609bp)的 PCR 产物设置两个酶切反应反应 A 用 Bsp1286I 酶、反应 B 用 Eae I 酶进行酶切,酶切反应体系的设置根据酶产品使用说明进行(参见附录 C)。

7.5 将酶切后的产物上样在 1.5% 的琼脂凝胶上,电压设定在 160 V,电泳 20 min 后在紫外光下检测

6.8 8 基因型确定

根据酶切产物的电泳结果(参见附录 D),确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型,见表 1。

表1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定

表.png

7 附录A(资料性附录)引物设计参照序列

342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG

342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG

342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG

342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA

342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA

342G CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA

342V GTCGGTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342A GTCGGCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342G GTCGGGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342V TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT

342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT

342G ATTTATGCGATTACACGAATTATTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCGGCTTCTTTGTGT

342V TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342A TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342G TTTCAACTTAGGAAAATCCCCAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342V CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA

342A CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA

342G CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTTTCCCTCGGCCCCAA

342V CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342A CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342G CTATAGATGGTGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342V GCGGTTACG

342A GCGGTTACG

342G GCGGTTACG

注:下划线分别对应上游引物与下游引物序列(反向互补); 方框内为编码342位氨基酸的密码子。

8 附录B(资料性附录)家蝇基因组 DNA 提取方法

B.1 取单头家蝇,去除腹部后置于 1.5mL体积的离心管 (eppendorf 管) 中,加入 0.5 mL 新鲜配制的裂解液(含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,10 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 1% SDS,0.15 mmol/L 精胺,0.5 mmol/L 亚精胺 和 2 U/mL的蛋白酶K),碾磨将虫体捣碎,置 60 ℃温浴,20 min后取出。

B.2 加入 75 μL的 8 M醋酸钾,混匀,置冰上 10 min。

B.3 14000 g 离心 5 min,取 400 μL上清液转至新的离心管。

B.4 加入 800 μL 冰冷的 100%乙醇,室温放置 10 min

B.5 离心 10 min,弃上清,离心沉淀用 500 μL的 70%乙醇清洗

B.6 离心 5 min,沉淀干燥后(可置超净台中,开通风),加入 50 μL灭菌水或TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH=8.0)中溶解。提取的DNA样品可直接用于PCR。样品保存 4 ℃备用,也可于 -20 ℃中长期保存

9 附录C(资料性附录)酶切体系设置范例

C.1 酶切反应体系的设置见表C.1。

表C.1 酶切反应体系

表.png

C.2 37℃下进行温浴,时间 2h~4h,反应结束,直接用于电泳检测

10 附录D(资料性附录)家蝇乙酰胆碱酯酶 342 位点不同基因型 PCR 产物的酶切结果

家蝇乙酰胆碱酯酶342位点不同基因型的PCR产物酶切结果见图D.1。

图.png

G——氨基酸残基为Gly(甘氨酸);

V——氨基酸残基为Val(缬氨酸);

A——氨基酸残基为Aal(丙氨酸);

G/G——敏感纯合子

V/V——不敏感 I型纯合子

A/A——不敏感II型纯合子

G/V——不敏感I型/敏感型杂合子

G/A——不敏感II型/敏感型杂合子

V/A——不敏感I型/不敏感II型杂合子

1——Bsp1286I酶切产物图;

2——EaeI酶切产物图。

注:最右侧道为DNA分子量标记。

图D.1 家蝇乙酰胆碱酯酶342位点不同基因型PCR产物的酶切结果

编辑:banlang、sun 审核:sun

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