1 拼音
WS/T 594—2018 yíng lèi kàng yào xìng jiǎn cè fāng fǎ jiā yíng bù mǐn gǎn yǐ xiān dǎn jiǎn zhǐ méi děng wèi jī yīn jiǎn cè fǎ
2 英文参考
Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica
3 基本信息
ICS 11.020
C 05
中华人民共和国卫生行业标准WS/T 594—2018《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法》(Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica)由中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会2018年3月1日《关于发布推荐性卫生行业标准〈蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法〉的通告》(国卫通〔2018〕3号)发布。该标准自2018年8月1日起施行。
4 发布通知
关于发布推荐性卫生行业标准《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法》的通告
国卫通〔2018〕3号
现发布推荐性卫生行业标准《蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法》,编号和名称如下:
WS/T 594—2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法
该标准自2018年8月1日起施行。
特此通告。
国家卫生计生委
2018年3月1日
5 前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准主要起草单位:中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。
本标准主要起草人:邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩。
6 标准正文
6.1 1 范围
本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。
6.2 2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
6.2.1 2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase
6.2.2 2.2 等位基因 allele
6.2.3 2.3 342G、342V 和 342A
342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)。
6.3 3 样本采集
采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内,浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在4 ℃条件下短期(6个月内)保存,可在-20 ℃以下长期保存。
6.4 4 引物
引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC,引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附录A。配制为10 μmol/L浓度,保存于-20 ℃冰柜。
6.5 5 仪器设备
5.1 PCR(聚合酶链式反应)仪。
5.3 凝胶成像仪。
5.4 恒温水浴锅。
6.6 6 主要试剂
6.1 DNA聚合酶(Taq酶)。
6.2 限制性内切酶Bsp1286I。
6.3 限制性内切酶Eae I。
6.7 7 操作步骤
7.1 在 PCR 管中加入 10×PCR 缓冲液 (含 100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2) 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL,引物 F 0.5 μL,引物 R 0.5 μL,单头家蝇的基因组 DNA 1 μL(100 ng~300 ng,提取方法可参见附录 B,也可用商售的 DNA 提取试剂盒或其他类似方法提取)和 Taq酶 (2~5 个单位),用灭菌水补齐至 25 μL,混匀。
7.2 将 PCR 管放入 PCR 仪中,设置 PCR 反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃30 s,35 个循环;72 ℃ 10 min。运行程序。
7.3 PCR 运行结束后,取 5 μL PCR 产物在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳,电压设定在 160 V,电泳20 min 后在紫外光下检测,有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR 产物用于进行以下酶切反应。
7.4 取合格样品(即电泳检测产物为 609bp)的 PCR 产物设置两个酶切反应,反应 A 用 Bsp1286I 酶、反应 B 用 Eae I 酶进行酶切,酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行(参见附录 C)。
7.5 将酶切后的产物上样在 1.5% 的琼脂糖凝胶上,电压设定在 160 V,电泳 20 min 后在紫外光下检测。
6.8 8 基因型确定
7 附录A(资料性附录)引物设计参照序列
342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC
342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC
342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC
342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG
342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG
342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG
342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC
342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC
342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC
342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA
342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA
342G CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA
342V GTCGGTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG
342A GTCGGCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG
342G GTCGGGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG
342V TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT
342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT
342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT
342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT
342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT
342G ATTTATGCGATTACACGAATTATTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCGGCTTCTTTGTGT
342V TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA
342A TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA
342G TTTCAACTTAGGAAAATCCCCAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA
342V CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA
342A CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA
342G CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTTTCCCTCGGCCCCAA
342V CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA
342A CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA
342G CTATAGATGGTGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA
342V GCGGTTACG
342A GCGGTTACG
342G GCGGTTACG
8 附录B(资料性附录)家蝇基因组 DNA 提取方法
B.1 取单头家蝇,去除腹部后置于 1.5mL体积的离心管 (eppendorf 管) 中,加入 0.5 mL 新鲜配制的裂解液(含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,10 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 1% SDS,0.15 mmol/L 精胺,0.5 mmol/L 亚精胺 和 2 U/mL的蛋白酶K),碾磨将虫体捣碎,置 60 ℃温浴,20 min后取出。
B.2 加入 75 μL的 8 M醋酸钾,混匀,置冰上 10 min。
B.3 14000 g 离心 5 min,取 400 μL上清液转至新的离心管。
B.4 加入 800 μL 冰冷的 100%乙醇,室温放置 10 min
B.5 离心 10 min,弃上清,离心沉淀用 500 μL的 70%乙醇清洗。
B.6 离心 5 min,沉淀干燥后(可置超净台中,开通风),加入 50 μL灭菌水或TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH=8.0)中溶解。提取的DNA样品可直接用于PCR。样品保存 4 ℃备用,也可于 -20 ℃中长期保存。